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免疫学

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论坛首页  >  免疫学讨论版   >  抗原|抗体技术
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【交流】单克隆抗体中建立ELISA方法的注意事项: [精华]

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楼主 口口草芳
口口草芳
丁香园准中级站友

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这个帖子发布于10年零199天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。

单抗讨论小组报名帖|\|/|单抗讨论小组日常讨论交流贴|\|/|\|/|单抗讨论小组工作交流与工资贴


最近园子里有很多战友问我有关在单抗制作中,如何利用ELISA筛选以及ELISA方法操作的注意事项,下面我先起个头吧,谈谈我的个人经验:)

ELISA,全称酶联免疫吸附实验,主要利用的是抗原抗体特异性结合的特点,可分为直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等。下面以间接法为例进行介绍:

1、方阵ELISA。用途:①融合前后确定鼠血清中抗体效价;②拿到单抗腹水后,需要建立ELISA方法时首先要确定包被原及抗体的最佳工作浓度。
经典的方阵ELISA:将抗原和抗体各自稀释成不同梯度浓度,结果OD值P/N>2的均判为阳性,选取OD值在1.0左右的那个Ag-Ab浓度为最佳工作浓度,其主要原因与酶标仪灵敏度有关。
但是,对于抗原抗体而言,由于它们被稀释成不同浓度,那么在理论上,每个抗原稀释度情况下,总有一个抗体的稀释度其OD值在1.0左右,那么到底选取哪一个OD值1.0左右的好呢?这就需要同时用药物做个抑制来看,哪个浓度下抑制情况好,就取哪个抗原抗体浓度做工作浓度。

相关链接:

如何用ELISA评价抗血清的效价

方阵滴定时,为什么选择OD值在1.0左右?

ELISA方法的建立中包被浓度的问题

2、间接竞争ELISA:在用方阵ELISA确定好抗原抗体最佳结合浓度后就可以做间接竞争ELISA了,其目的主要是考察抗体的特异性、绘制标准曲线,计算抗体对抗原的半数抑制、检测限等参数,也可以用来检测未知样品中的抗体。方法是用确定的抗原包被,在加一抗时同时加入不同浓度的标准品(一般是药物),然后加二抗,显色。用药物(即标准品)浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标,绘制ELISA标准曲线,计算相关的参数,之后就可以将未知的样品所测OD值代入曲线方程求其中抗体的含量。通常这是建立ELISA检测方法的必备项目。

标准曲线可以绘成直线或是曲线(二次方程或三次方程)。通常是选取线性比较好的几个点绘成直线。直线斜率越高说明抗体的特异性及灵敏性好,R2
值越靠近1,则说明线性关系好。曲线绘好后,有一些常用的参数,如抑制率、半数抑制、检测限、定量限、标准偏差、变异系数等等:

抑制率(%)=1-B/B0(B0为不含药物的OD值;B为含有药物的OD值)
标准差(SD)=[∑(Xi-B ) 2 / (n-1)] 1/2;
标准偏差(RSD)=SD/B
半数抑制:指用药物(半抗原)去做竞争实验时呈现50%抑制效果时的药物浓度。药物浓度越低,而抑制率越高,则表示抗体对药物的特异性越好,灵敏度也高。半数抑制浓度IC50对应的OD值:OD IC50=0.5•B0
检测下限(LOD)对应的OD值:ODLOD =B0-3SD;
定量限(LOQ)对应的OD值:ODLOQ = B0-10SD;

3、间接ELISA操作中具体注意的问题:
间接ELISA一般有6个步骤:包被抗原、封闭、加一抗(在做竞争时同时加入药物)、加二抗、显色、终止。其中除了加显色和终止外,其余步骤之间都要进行洗板。在这里面,每一步都非常重要,假如有一步疏忽都会造成结果的不准确。通常ELISA结果会出现如空白显色、阴性偏高、方阵梯度不明显,还有如何提高间接竞争ELISA灵敏度等问题,其具体问题及解决方法总结如下:

新手ELISA请赐教

为什么我的ELISA结果如此奇怪?

ELISA阴性值偏高是什么原因?

ELISA方法建立中包被浓度的问题

ELISA中遇到的问题,请高手指点

间接竞争ELISA如何提高灵敏度

ELISA封闭液的配置

ELISA中碰到的问题

ELISA酶联免疫吸附,间接法测定抗体的问题

由于时间仓促,就先整理了这么多,希望各位战友都进来参与讨论,交流经验!

  • 亲和常数测定方法.pdf(144.33k)
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2007-10-10 19:46 浏览 : 29200 回复 : 59
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口口草芳 编辑于 2008-01-20 10:20
  • • 你们医院最贵的 VIP 病房是什么样?

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hong508
hong508
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leekoo
(目标多肽X为分子量3000的半抗原,E.coli表达的GST-X直接作为抗原免疫的兔子,GST(分子量27000)。拿到抗血清后33%的硫酸铵沉淀了三次,过蛋白A柱纯化,间接Elisa检查抗体效价。二抗为羊抗兔(HRP),1%BSA封闭。

  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12  
A  2.296  1.189  0.676  0.415  0.403  0.333  0.160  0.321  0.360  2.504  2.42  2.237  
B  2.173  1.357  0.630  0.383  0.348  0.305  0.311  0.288  0.290  0.376  0.399  0.446  

A,B板条为捕获抗原 ( HSA-X ) 过量包板( 50ug/ml )
A,B1-A,B9为1/200,1/400,1/800,1/1600......倍比稀释抗体(已蛋白A柱纯化)
A10-A12为1/10抗体,做为阳性空
B10-B12为PBS代替抗体的空白孔
450nm检测

结果分析:
A7 显色明显淡,操作时的意外,显色液B滴加量不够
板条B好像比板条A各孔均低0.04,看来板条间也有差异,以后应该每个板条都做阳性,空白对照。
看不明白的是,为什么高度稀释的抗体的孔的值比空白孔的还要低呢?
估计抗体的效价应该在1:1000左右吧,蛋白A柱纯化的抗体效价这么还这么低啊
我需要的是针对X的抗体,GST抗体不需要


几点个人建议:
1,从结果分析,你的抗体效价不是很高,大约1:1000左右,可能原因是抗体本身或纯化造成的。
2,你的空白PBS代替的孔显色大概在0.2-0.3左右,空白值太高,可能封闭效果不良造成。
3,关于A条比B条高出约0.4的OD值,作为一般的测定,应是可以接受的。若是在试剂盒的研发中则不行。
4,从你NH4SO4沉淀,为什么3次都用33%呢?既然你要粗纯,那么两次应该够了,即50%-30%,再上柱。
个人建议,供参考,多交流!
2007-11-27 13:54
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xiaoxiong827
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这里讲的是竞争ELISA:当样品中有被检药物时,它们竞争结合抗小分子的抗体,使OD值下降,也就说OD值和样品中的药物浓度在一定范围内呈负相关。B0是不含药物时的OD值,这个值是最大的。检测限是刚好能反应有药物添加时的浓度,这时不能有效的确定到底添加了多少,它对应的OD值比B0低,并且差异极显著(P小于等于0.01)。定量检测时,药物添加浓度必须继续加大,所以这时OD值应该比检测限时的OD值低。

楼上说的定量限的值小于检测下限是理解错误!定量限的药物浓度肯定高于检测下限,但OD值却低于检测下限。
2007-11-08 18:34
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好,不错,顶一下,呵呵
2007-10-11 21:21
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