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【交流】单克隆抗体中建立ELISA方法的注意事项： [精华]

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楼主

口口草芳

丁香园准中级站友

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1楼

这个帖子发布于11年零11天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

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最近园子里有很多战友问我有关在单抗制作中，如何利用ELISA筛选以及ELISA方法操作的注意事项，下面我先起个头吧，谈谈我的个人经验：）

ELISA，全称酶联免疫吸附实验，主要利用的是抗原抗体特异性结合的特点，可分为直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等。下面以间接法为例进行介绍：

1、方阵ELISA。用途：①融合前后确定鼠血清中抗体效价；②拿到单抗腹水后，需要建立ELISA方法时首先要确定包被原及抗体的最佳工作浓度。
经典的方阵ELISA：将抗原和抗体各自稀释成不同梯度浓度，结果OD值P/N>2的均判为阳性，选取OD值在1.0左右的那个Ag-Ab浓度为最佳工作浓度，其主要原因与酶标仪灵敏度有关。
但是，对于抗原抗体而言，由于它们被稀释成不同浓度，那么在理论上，每个抗原稀释度情况下，总有一个抗体的稀释度其OD值在1.0左右，那么到底选取哪一个OD值1.0左右的好呢？这就需要同时用药物做个抑制来看，哪个浓度下抑制情况好，就取哪个抗原抗体浓度做工作浓度。

相关链接：

如何用ELISA评价抗血清的效价

方阵滴定时，为什么选择OD值在1.0左右?

ELISA方法的建立中包被浓度的问题

2、间接竞争ELISA：在用方阵ELISA确定好抗原抗体最佳结合浓度后就可以做间接竞争ELISA了，其目的主要是考察抗体的特异性、绘制标准曲线，计算抗体对抗原的半数抑制、检测限等参数，也可以用来检测未知样品中的抗体。方法是用确定的抗原包被，在加一抗时同时加入不同浓度的标准品（一般是药物），然后加二抗，显色。用药物（即标准品）浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标，绘制ELISA标准曲线，计算相关的参数，之后就可以将未知的样品所测OD值代入曲线方程求其中抗体的含量。通常这是建立ELISA检测方法的必备项目。

标准曲线可以绘成直线或是曲线（二次方程或三次方程）。通常是选取线性比较好的几个点绘成直线。直线斜率越高说明抗体的特异性及灵敏性好，R2
值越靠近1，则说明线性关系好。曲线绘好后，有一些常用的参数，如抑制率、半数抑制、检测限、定量限、标准偏差、变异系数等等：

抑制率（%）＝1－B/B0（B0为不含药物的OD值；B为含有药物的OD值）
标准差（SD）＝[∑(Xi－B ) 2 / (n－1)] 1/2；
标准偏差（RSD）＝SD/B
半数抑制：指用药物（半抗原）去做竞争实验时呈现50%抑制效果时的药物浓度。药物浓度越低，而抑制率越高，则表示抗体对药物的特异性越好，灵敏度也高。半数抑制浓度IC50对应的OD值：OD IC50＝0.5•B0
检测下限（LOD）对应的OD值：ODLOD =B0－3SD；
定量限（LOQ）对应的OD值：ODLOQ = B0－10SD；

3、间接ELISA操作中具体注意的问题：
间接ELISA一般有6个步骤：包被抗原、封闭、加一抗（在做竞争时同时加入药物）、加二抗、显色、终止。其中除了加显色和终止外，其余步骤之间都要进行洗板。在这里面，每一步都非常重要，假如有一步疏忽都会造成结果的不准确。通常ELISA结果会出现如空白显色、阴性偏高、方阵梯度不明显，还有如何提高间接竞争ELISA灵敏度等问题，其具体问题及解决方法总结如下：

新手ELISA请赐教

为什么我的ELISA结果如此奇怪?

ELISA阴性值偏高是什么原因?

ELISA方法建立中包被浓度的问题

ELISA中遇到的问题,请高手指点

间接竞争ELISA如何提高灵敏度

ELISA封闭液的配置

ELISA中碰到的问题

ELISA酶联免疫吸附，间接法测定抗体的问题

由于时间仓促，就先整理了这么多，希望各位战友都进来参与讨论，交流经验！