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【交流】单克隆抗体中建立ELISA方法的注意事项： [精华]

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楼主

口口草芳

丁香园准中级站友

+1 积分
1楼

这个帖子发布于10年零282天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。

单抗讨论小组报名帖|\|/|单抗讨论小组日常讨论交流贴|\|/|\|/|单抗讨论小组工作交流与工资贴

最近园子里有很多战友问我有关在单抗制作中，如何利用ELISA筛选以及ELISA方法操作的注意事项，下面我先起个头吧，谈谈我的个人经验：）

ELISA，全称酶联免疫吸附实验，主要利用的是抗原抗体特异性结合的特点，可分为直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等。下面以间接法为例进行介绍：

1、方阵ELISA。用途：①融合前后确定鼠血清中抗体效价；②拿到单抗腹水后，需要建立ELISA方法时首先要确定包被原及抗体的最佳工作浓度。
经典的方阵ELISA：将抗原和抗体各自稀释成不同梯度浓度，结果OD值P/N>2的均判为阳性，选取OD值在1.0左右的那个Ag-Ab浓度为最佳工作浓度，其主要原因与酶标仪灵敏度有关。
但是，对于抗原抗体而言，由于它们被稀释成不同浓度，那么在理论上，每个抗原稀释度情况下，总有一个抗体的稀释度其OD值在1.0左右，那么到底选取哪一个OD值1.0左右的好呢？这就需要同时用药物做个抑制来看，哪个浓度下抑制情况好，就取哪个抗原抗体浓度做工作浓度。

相关链接：

如何用ELISA评价抗血清的效价

方阵滴定时，为什么选择OD值在1.0左右?

ELISA方法的建立中包被浓度的问题

2、间接竞争ELISA：在用方阵ELISA确定好抗原抗体最佳结合浓度后就可以做间接竞争ELISA了，其目的主要是考察抗体的特异性、绘制标准曲线，计算抗体对抗原的半数抑制、检测限等参数，也可以用来检测未知样品中的抗体。方法是用确定的抗原包被，在加一抗时同时加入不同浓度的标准品（一般是药物），然后加二抗，显色。用药物（即标准品）浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标，绘制ELISA标准曲线，计算相关的参数，之后就可以将未知的样品所测OD值代入曲线方程求其中抗体的含量。通常这是建立ELISA检测方法的必备项目。

标准曲线可以绘成直线或是曲线（二次方程或三次方程）。通常是选取线性比较好的几个点绘成直线。直线斜率越高说明抗体的特异性及灵敏性好，R2
值越靠近1，则说明线性关系好。曲线绘好后，有一些常用的参数，如抑制率、半数抑制、检测限、定量限、标准偏差、变异系数等等：

抑制率（%）＝1－B/B0（B0为不含药物的OD值；B为含有药物的OD值）
标准差（SD）＝[∑(Xi－B ) 2 / (n－1)] 1/2；
标准偏差（RSD）＝SD/B
半数抑制：指用药物（半抗原）去做竞争实验时呈现50%抑制效果时的药物浓度。药物浓度越低，而抑制率越高，则表示抗体对药物的特异性越好，灵敏度也高。半数抑制浓度IC50对应的OD值：OD IC50＝0.5•B0
检测下限（LOD）对应的OD值：ODLOD =B0－3SD；
定量限（LOQ）对应的OD值：ODLOQ = B0－10SD；

3、间接ELISA操作中具体注意的问题：
间接ELISA一般有6个步骤：包被抗原、封闭、加一抗（在做竞争时同时加入药物）、加二抗、显色、终止。其中除了加显色和终止外，其余步骤之间都要进行洗板。在这里面，每一步都非常重要，假如有一步疏忽都会造成结果的不准确。通常ELISA结果会出现如空白显色、阴性偏高、方阵梯度不明显，还有如何提高间接竞争ELISA灵敏度等问题，其具体问题及解决方法总结如下：

新手ELISA请赐教

为什么我的ELISA结果如此奇怪?

ELISA阴性值偏高是什么原因?

ELISA方法建立中包被浓度的问题

ELISA中遇到的问题,请高手指点

间接竞争ELISA如何提高灵敏度

ELISA封闭液的配置

ELISA中碰到的问题

ELISA酶联免疫吸附，间接法测定抗体的问题

由于时间仓促，就先整理了这么多，希望各位战友都进来参与讨论，交流经验！

亲和常数测定方法.pdf(144.33k)

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2007-10-10 19:46 浏览 : 31112 回复 : 61

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口口草芳编辑于 2008-01-20 10:20

• 马克斯-普朗克研究院佛罗里达神经科学研究所王映雪实验室招聘博士后和博士研究生

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hong508

铁杆站友

+1 积分
24楼

leekoo
（目标多肽X为分子量3000的半抗原，E.coli表达的GST-X直接作为抗原免疫的兔子，GST（分子量27000）。拿到抗血清后33%的硫酸铵沉淀了三次，过蛋白A柱纯化，间接Elisa检查抗体效价。二抗为羊抗兔（HRP），1%BSA封闭。

  1  2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12
A  2.296  1.189  0.676  0.415  0.403  0.333  0.160  0.321  0.360  2.504  2.42  2.237
B  2.173  1.357  0.630  0.383  0.348  0.305  0.311  0.288  0.290  0.376  0.399  0.446

A,B板条为捕获抗原（ HSA-X ）过量包板( 50ug/ml ）
A,B1-A,B9为1/200,1/400,1/800,1/1600......倍比稀释抗体（已蛋白A柱纯化）
A10-A12为1/10抗体，做为阳性空
B10-B12为PBS代替抗体的空白孔
450nm检测

结果分析：
A7 显色明显淡，操作时的意外，显色液B滴加量不够
板条B好像比板条A各孔均低0.04，看来板条间也有差异，以后应该每个板条都做阳性，空白对照。
看不明白的是，为什么高度稀释的抗体的孔的值比空白孔的还要低呢？
估计抗体的效价应该在1：1000左右吧，蛋白A柱纯化的抗体效价这么还这么低啊
我需要的是针对X的抗体，GST抗体不需要

几点个人建议：
1，从结果分析，你的抗体效价不是很高，大约1：1000左右，可能原因是抗体本身或纯化造成的。
2，你的空白PBS代替的孔显色大概在0.2－0.3左右，空白值太高，可能封闭效果不良造成。
3，关于A条比B条高出约0.4的OD值，作为一般的测定，应是可以接受的。若是在试剂盒的研发中则不行。
4，从你NH4SO4沉淀，为什么3次都用33％呢？既然你要粗纯，那么两次应该够了，即50％－30％，再上柱。
个人建议，供参考，多交流！

2007-11-27 13:54

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xiaoxiong827

铁杆站友

+1 积分
8楼

这里讲的是竞争ELISA：当样品中有被检药物时，它们竞争结合抗小分子的抗体，使OD值下降，也就说OD值和样品中的药物浓度在一定范围内呈负相关。B0是不含药物时的OD值，这个值是最大的。检测限是刚好能反应有药物添加时的浓度，这时不能有效的确定到底添加了多少，它对应的OD值比B0低，并且差异极显著（P小于等于0.01）。定量检测时，药物添加浓度必须继续加大，所以这时OD值应该比检测限时的OD值低。

楼上说的定量限的值小于检测下限是理解错误！定量限的药物浓度肯定高于检测下限，但OD值却低于检测下限。

2007-11-08 18:34

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byd123

丁香园荣誉版主

2楼

好，不错，顶一下，呵呵

2007-10-11 21:21

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